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一种毛白杨胚囊的分离方法

  • 发布时间: 2024-12-18
预算 双方协商
基本信息
成果方:保定学院
合作方式:技术转让
成果类型:发明专利,
行业领域
农业技术
成果描述

利用酶解-解剖法结合吸吹的方法,从新鲜毛白杨胚珠中分离得到了完整的胚囊,获得率高达8.7%;同时筛选出分离毛白杨胚珠的混合酶液成分包括半纤维素酶、纤维素酶、果胶酶、甘露醇、BSA,酶解处理后经过醋酸洋红染色和透明处理,在倒置显微镜下观察,看到了完整清楚的毛白杨胚囊的形态与内部结构,呈长椭圆形,大小为2.52µm左右,单珠被,5-6层珠心细胞,珠孔端有卵器细胞存在,合点端有类似反足细胞的结构。该技术方案同样可应用于长寿花的胚囊分离中。

应用范围

动物和低等植物而言进行精、卵细胞的离体操作实验相对容易,原因是在其受精过程中,精细胞与卵细胞的融合是在脱离或半脱离母体的状态下完成的,因此取得的研究结果也较为深入。然而高等植物则不同,其卵细胞深藏在子房中的胚珠深处,为卵细胞的发育机理和离体操作研究带来了很大的困难。利用分离的精细胞、卵细胞在体外诱导融合、重演受精过程的离体受精技术排除了体细胞组织的干扰,使定点追踪受精过程中卵细胞由受精引起的细胞和分子变化得以实现,这也是目前研究受精机制的主要有效手段。分离植物生活卵细胞是进行植物生殖细胞工程研究的基础之一,而卵细胞位于胚囊之中,因此分离生活胚囊是分离生活卵细胞的第一步。而分离的胚囊可以观察到卵细胞进而可利用一定的方法得到卵细胞,卵细胞不仅可以用以开展离体受精研究,也可提供用分子生物学方法研究被子植物卵细胞发育和合子发育机理的实验基础。前苏联学者最早采用酶解法分离胚珠得到生活胚囊。我国学者在金鱼(Antirrhinum majus L.)、烟草(Nicotiana tabacum)中进行了分离生活胚囊的研究工作,目前已从一些植物中分离出生活胚囊及其组分。Kranz等应用分离的玉米(Zea mays L)精、卵细胞体外诱导融合并成功地再生出可育植株。14年后,第二例离体受精实验在水稻中也获得成功。之后从牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)、蓝猪耳(Torenia fournierri Linden.ex Fourn.)和黄花木曼陀罗(Datura aurea)等植物中分离出生活的胚囊或卵细胞等其他结构。

前景分析
本发明的技术方案利用酶解-解剖法结合吸吹的方法,从新鲜毛白杨胚珠中分离得到了大量完整的胚囊。筛选出分离毛白杨胚珠的最佳混合酶液成分和浓度:0.5%半纤维素酶、0.5%纤维素酶、0.1%果胶酶、1%BSA、10%甘露醇;酶解处理2.5h是最适宜的;完整胚囊获得率高达8.7%左右。在倒置显微镜下可以观察到:毛白杨胚囊呈长椭圆形,大小为2.52μm;胚珠经透明处理后,可以观察到毛白杨胚囊为单珠被,5-6层珠心细胞,合点端有类似反足细胞的结构。为杨树卵细胞分离及生殖生物学的研究提供了基础材料,也为杨树的离体受精探索创造了条件,对杨树的转基因研究、远缘杂交育种具有巨大的潜在的应用价值。
利用酶解-解剖的方法可分离完整的长寿花胚囊。在最佳分离条件下,由于胚囊较小,且酶解之后需要手动解剖,最后的胚囊得率很低,2h大约50枚胚珠用于实验,最后只有5-6枚胚囊。但这样的分离数量还是完全可以进行之后的卵细胞、助细胞或中央细胞的分离,也为植物胚囊发育、生殖学的研究创造了条件。


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    崔彬彬

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